酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）作為一種廣泛應(yīng)用的免疫檢測(cè)技術(shù)，在臨床診斷、疾病研究、食品安全檢測(cè)以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其核心是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，并通過酶促化學(xué)反應(yīng)將這種結(jié)合轉(zhuǎn)化為可定量或定性測(cè)量的信號(hào)。根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求的不同，
ELISA試劑盒的設(shè)計(jì)呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)，包括但不限于雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體以及應(yīng)用親和素-生物素系統(tǒng)的ELISA等。
1.雙抗體夾心法（Sandwich ELISA）
在雙抗體夾心法中，首先將針對(duì)目標(biāo)抗原的捕獲抗體固定于固相載體上形成固相抗體層，然后加入待測(cè)樣本使得抗原與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的成分后，再加入能與抗原另一表位結(jié)合的酶標(biāo)抗體。經(jīng)過進(jìn)一步的溫育和洗滌步驟，最后通過酶催化底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，顏色深淺與樣本中的抗原含量成正比，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。
2.間接法ELISA
間接法ELISA中，固相載體上的抗體同樣用于捕獲抗原，但后續(xù)步驟有所不同。此處不是加入酶標(biāo)抗體，而是先加入待測(cè)樣本并允許抗原與抗體結(jié)合后，再添加酶標(biāo)記的抗體（通常為抗物種抗體），它與樣本中的抗體結(jié)合而非直接與抗原結(jié)合。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于它可以檢測(cè)多種類型的抗體，但由于增加了步驟，可能面臨交叉反應(yīng)和背景較高的風(fēng)險(xiǎn)。
3.競(jìng)爭(zhēng)法ELISA
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中，待測(cè)樣本和酶標(biāo)記的抗原同時(shí)與有限的抗體結(jié)合。樣本中的抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一個(gè)抗體位點(diǎn)，因此，樣本中抗原濃度越高，結(jié)合到固相抗體的酶標(biāo)記抗原就越少，最終產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度越弱。此法適用于測(cè)定小分子抗原或多肽類物質(zhì)。
4.雙位點(diǎn)一步法ELISA
在這種設(shè)計(jì)中，抗原和酶標(biāo)抗體預(yù)先偶聯(lián)形成復(fù)合物，然后一起加入到固相抗體預(yù)包被的板孔中。如果待測(cè)樣本中含有相同抗原，則會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗體，導(dǎo)致酶標(biāo)抗原-抗原復(fù)合物的結(jié)合減少。隨后的酶催化反應(yīng)及顯色步驟可用于定量分析。
5.IgM抗體捕獲法
專門用于檢測(cè)IgM類抗體的捕獲法，通過固相包被抗人IgM抗體，使樣本中的IgM首先結(jié)合到固相上，之后加入抗原以捕獲與IgM特異性結(jié)合的部分，再通過酶標(biāo)抗體檢測(cè)。此法特別適合于急性感染早期的IgM抗體檢測(cè)。
6.親和素-生物素系統(tǒng)（ABC-ELISA）
利用親和素對(duì)生物素很高的親和力，可以將生物素標(biāo)記到抗體或抗原上，而酶則標(biāo)記在親和素上。這樣既簡(jiǎn)化了標(biāo)記步驟，又提高了靈敏度和特異性。
制作工藝
-抗原或抗體的純化與標(biāo)記：選擇合適的抗原或抗體，通過物理、化學(xué)或生物方法進(jìn)行純化，并將其與酶（如辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP）或其他標(biāo)記物（如生物素）共價(jià)連接。
-固相包被：將標(biāo)記好的抗體或抗原均勻地固定在塑料微孔板或其他固相載體表面，形成穩(wěn)定的固相層。
-試劑配制與質(zhì)量控制：制備標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液、酶標(biāo)抗體溶液、底物溶液以及終止液等，并對(duì)每批試劑盒進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和性能驗(yàn)證。
-封裝與保存：將各組分分裝至專用試劑瓶或管中，按照適宜條件密封保存，確保試劑盒的穩(wěn)定性和有效性。
ELISA試劑盒的設(shè)計(jì)與制作工藝復(fù)雜且精密，每一種方法都需要精心設(shè)計(jì)以滿足特定的檢測(cè)需求，從抗原抗體的選擇與標(biāo)記，到固相載體的處理，再到整套試劑盒的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，每一個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性產(chǎn)生直接影響。
